問題狀態(tài)

HPLC原理就是利用固定相與流動(dòng)相的極性的差異,而達(dá)到分散物質(zhì)目的。

(一)有效液相色譜闡發(fā)的流程

由泵將儲(chǔ)液瓶中的溶劑吸入色譜系統(tǒng),然后輸出,經(jīng)流量與壓力測(cè)量之后,導(dǎo)入進(jìn)樣器。被測(cè)物由進(jìn)樣器注入,并隨流動(dòng)相通過色譜柱,在柱上進(jìn)行分散后進(jìn)入檢測(cè)器,檢測(cè)信號(hào)由數(shù)據(jù)處理設(shè)備收羅與處理,并記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。遇到復(fù)雜的混合物分散(極性范圍比較寬)還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似,不同的是氣相色譜轉(zhuǎn)變溫度,

而HPLC轉(zhuǎn)變的是流動(dòng)相極性,使樣品各組分在***佳條件下患上以分散。

有效液相色譜法按分散機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及份子排阻色譜法。

1.液固色譜法 使用固體吸附劑,被分散組分在色譜柱上分散原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分散。分散過程是一個(gè)吸附-解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁,粒度5~10μm。適用于分散份子量200~1000的組分,大多數(shù)用于非離子型化合物,離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分散同分異構(gòu)體。

2.液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面,或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相,分散原理是根據(jù)被分散的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分散。分散過程是一個(gè)分配平衡過程。

涂布式固定響應(yīng)具有杰出的惰性;流動(dòng)相須***預(yù)先用固定相飽和,以減少固定相從擔(dān)體表面流失;溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化;另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分散和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失,現(xiàn)在已很少接納?，F(xiàn)在多接納的是化學(xué)鍵合固定相,如C18、C8、氨基柱、***基柱和苯基柱。

液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。

正相色譜法 接納極性固定相(如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相);流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑(烷烴類如正已烷、環(huán)已烷),常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分散中常極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類、***類、羰基類及氨基酸類等)。

反相色譜法 一般用非極性固定相(如C18、C8);流動(dòng)相為水或緩沖液,常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙***、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分散非極性和極性較弱的化合物。RPC在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用***為廣泛,據(jù)統(tǒng)計(jì),它占全般HPLC應(yīng)用的80%擺布。

跟著柱填料的快速成長(zhǎng),反相色譜法的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大,現(xiàn)已應(yīng)用于某些無機(jī)樣品或易解離樣品的闡發(fā)。為控制樣品在闡發(fā)過程的解離,常用緩沖液控制流動(dòng)相的pH值。但需要注意的是,C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5(2~8),太高的pH值會(huì)使硅膠溶解,太低的pH值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法

反相色譜法

固定相極性

高～中

中～低

流動(dòng)相極性

低～中

中～高

組分洗脫次序

極性小先洗出

極性大先洗出

從上表可看出,當(dāng)極性為中常時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒有較著的界線(如氨基鍵合固定相)。

3.離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂,常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架,在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基(稱陽(yáng)離子交換樹脂)或季氨基(陰離子交換樹脂)。被分散組分在色譜柱上分散原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換,根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷魔力而分散。

緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分散組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分散子與樹脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外,它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。pH值可轉(zhuǎn)變化合物的解離程度,繼續(xù)往前影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大,則離子強(qiáng)度高,不利于樣品的解離,導(dǎo)致樣品較快流出。離子交換色譜法主要用于闡發(fā)有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。

4.離子對(duì)色譜法 又稱偶離子色譜法,是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分散子與離子對(duì)試藥離子形成中性的離子對(duì)化合物后,在非極性固定相中溶解度增大,從而使其分散效果改善。主要用于闡發(fā)離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。

闡發(fā)堿性物質(zhì)常用的離子對(duì)試藥為烷基磺酸鹽,如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種堿性樣品形成很強(qiáng)的離子對(duì)。

闡發(fā)酸性物質(zhì)常用四丁基季銨鹽,如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。

離子對(duì)色譜法常用ODS柱(即C18),流動(dòng)相為甲醇-水或乙腈-水,水中加入3~10 mmol/L的離子對(duì)試藥,在一定的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行分散。被測(cè)組分保時(shí)間與離子對(duì)性質(zhì)、濃度、流動(dòng)相組成及其pH值、離子強(qiáng)度有關(guān)。

5.排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料,流動(dòng)相是可以溶解樣品的溶劑。小份子量的化合物可以進(jìn)入孔中,滯留時(shí)間長(zhǎng);大份子量的化合物不能進(jìn)入孔中,直接隨流動(dòng)相流出。它利用份子篩對(duì)份子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分散。常用于分散高份子化合物,如社團(tuán)提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。

正相色譜法

反相色譜法

固定相極性

高～中

中～低

流動(dòng)相極性

低～中

中～高

組分洗脫次序

極性小先洗出

極性大先洗出

有效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上,引用了氣相色譜的理論,在技能上,流動(dòng)相改為高壓運(yùn)送(***高運(yùn)送壓力可達(dá)4.9′107Pa);色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成,從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜(每米塔板數(shù)可達(dá)幾萬或幾十萬);同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器,可對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)檢測(cè)。

特點(diǎn)

1.高壓:液相色譜法以液體為流動(dòng)相(稱為載液),液體流經(jīng)色譜柱,受到阻力較大,為了迅速地通過色譜柱,須***對(duì)載液施加高壓。一般可達(dá)150～350×105Pa。

2. 高速:流動(dòng)相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快患上多,一般可達(dá)1～10ml/min。有效液相色譜法所需的闡發(fā)時(shí)間較之經(jīng)典液相色譜法少患上多,一般少于 1h 。

3. 有效:近來研究出很多新型固定相,使分散效率大大提高。

4.高靈敏度:有效液相色譜已廣泛接納高靈敏度的檢測(cè)器,進(jìn)一步提高了闡發(fā)的靈敏度。如熒光檢測(cè)器靈敏度可達(dá)10-11g。另外,用樣量小,一般幾個(gè)微升。

5.順應(yīng)范圍寬:氣相色譜法與有效液相色譜法的比較:氣相色譜法雖具有分散能力好,靈敏度高,闡發(fā)速度快,操作方便等優(yōu)點(diǎn),但是受技能條件的限制,沸點(diǎn)太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進(jìn)行闡發(fā)。而有效液相色譜法,只要求試樣能制成溶液,而不需要?dú)饣?因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對(duì)于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、相對(duì)份子量大(大于 400 以上)的有機(jī)物(這些物質(zhì)幾乎占有機(jī)物總額的 75% ～ 80% )原則上都可應(yīng)用有效液相色譜法來進(jìn)行分散、闡發(fā)。 據(jù)統(tǒng)計(jì),在已知化合物中,能用氣相色譜闡發(fā)的約占20%,而能用液相色譜闡發(fā)的約占70～80%。

有效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為有效凝膠色譜、疏水性有效液相色譜、反相有效液相色譜、有效離子交換液相色譜、有效親和液相色譜以及有效會(huì)聚液相色譜等類型。用不******型的有效液相色譜分散或闡發(fā)各類化合物的原理基本上與相對(duì)應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是有效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、反復(fù)性好,

有效液相色譜儀主要有進(jìn)樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、.分散系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),下面將別離敘述其各自的組成與特點(diǎn)。

1.進(jìn)樣系統(tǒng)

一般接納隔閡注射進(jìn)樣器或高壓進(jìn)樣間完成進(jìn)樣操作,進(jìn)樣量是恒定的。這對(duì)提高闡發(fā)樣品的反復(fù)性是有益的。

2.輸液系統(tǒng)

該系統(tǒng)包括高壓泵、流動(dòng)相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強(qiáng)為l.47～4.4X107Pa,流速可調(diào)且穩(wěn)定,當(dāng)高壓流動(dòng)相通過層析柱時(shí),可降低樣品在柱中的擴(kuò)散效應(yīng),可加速其在柱中的移動(dòng)速度,這對(duì)提高分辨率、回收樣品、連結(jié)樣品的生物活性等都是有利的。流動(dòng)相貯存錯(cuò)和梯度儀,可使流動(dòng)相隨固定相和樣品的性質(zhì)而轉(zhuǎn)變,包括轉(zhuǎn)變洗脫液的極性、離子強(qiáng)度、PH值,或改用競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑或變性劑等。這就可使各類物質(zhì)(即使***有一個(gè)基團(tuán)的差別或是同分異構(gòu)體)都能獲患上有用分散。

3.分散系統(tǒng)

該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長(zhǎng)度為10～50cm(需要兩根連用時(shí),可在二者之間加一連接管),內(nèi)徑為2～5mm,由"優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁試管或鈦合金等材料制成,住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相(由基質(zhì)和固定液構(gòu)成).固定相中的基質(zhì)是由機(jī)械強(qiáng)度高的樹脂或硅膠構(gòu)成,它們都有惰性(如硅膠表面的硅酸基因基本已除去)、多孔性(孔徑可達(dá)1000?)和比表面積大的特點(diǎn),加之其表面經(jīng)過機(jī)械涂漬(與氣相色譜中固定相的制備一樣),或用化學(xué)法偶聯(lián)各類基因(如磷酸基、季***基、羥甲基、苯基、氨基或各類長(zhǎng)度碳鏈的烷基等)或配體的有機(jī)化合物。因此,這種固定相對(duì)結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有杰出的選擇性。例如,在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素(PSA)后,就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分散出來。

另外,固定相基質(zhì)粒小,柱床極易達(dá)到均勻、致密狀態(tài),極易降低渦流擴(kuò)散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小,微孔淺,樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對(duì)縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論闡發(fā),基質(zhì)粒度小,塔板理論數(shù)N就越大。這也進(jìn)一步證實(shí)基質(zhì)粒度小,會(huì)提高分辨率的道理。

再者,有效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C,通過改善傳質(zhì)速度,縮短闡發(fā)時(shí)間,就可增加層析柱的效率。

4.檢測(cè)系統(tǒng)

有效液相色譜常用的檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器三種。

(1)紫外檢測(cè)器

該檢測(cè)器適用于對(duì)紫外光(或可見光)有吸收性能樣品的檢測(cè)。其特點(diǎn):使用面廣(如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用);靈敏度高(檢測(cè)下限為10-10g/ml);線性范圍寬;對(duì)溫度和流速變化不敏感;可檢測(cè)梯度溶液洗脫的樣品。

(2)示差折光檢測(cè)器

凡具有與流動(dòng)相折光率不同的樣品組分,均可使用示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。目前,糖類化合物的檢測(cè)大多使用此檢測(cè)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)通用性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單,但靈敏度低(檢測(cè)下限為10-7g/ml),流動(dòng)相的變化會(huì)引起折光率的變化,因此,它既不舒服用于痕量闡發(fā),也不舒服用于梯度洗脫樣品的檢測(cè)。

(3)熒光檢測(cè)器

凡具有熒光的物質(zhì),在一定條件下,其發(fā)射光的熒光強(qiáng)度與物質(zhì)的濃度成正比。因此,這一檢測(cè)器只適用于具有熒光的有機(jī)化合物(如多環(huán)芳烴、氨基酸、***類、維生素和某些蛋白質(zhì)等)的測(cè)定,其靈敏度很高(檢測(cè)下限為10-12～10-14g/ml),痕量闡發(fā)和梯度洗脫作品的檢測(cè)均可接納。

(5)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)

該系統(tǒng)可對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行收羅、貯存、顯示、打印和處理等操作,使樣品的分散、制備或鑒定工作能正確開展。